1. Úvod. Co je proteomika?
  2. Jaké jiné –omy ješte existují?
  3. Projekty řešené současnou proteomikou
  4. Lze proteiny patentovat stejne jako geny?
  5. Kdo koordinuje výzkum v proteomice?
  6. Nástroje současné proteomiky – od laboratorních technik k proteomickým továrnám
  7. Nejdůležitejší výsledky proteomiky v posledních letech
  8. Závěr a perspektivy
  9. Doporučená literatura
  10. Webové stránky

Úvod. Co je proteomika?

Termín „proteom” byl zaveden v roce 1994 Marcem R. Wilkinsem, vedoucím bioinformatiky u firmy Proteome Systems v Sydney, pro označení veškerého proteinového komplementu kodovaného genomem. Existuje téměř tolik definic tohoto termínu, kolik je pracovníků v proteomice. Většina z nich se v podstatě shoduje, že výzkum proteomu zahrnuje tři základní aktivity: identifikaci veškerých proteinů produkovaných určitou buňkou, tkání nebo organismem, definici vzájemných interakcí těchto proteinů nezbytných pro určitou biologickou funkci, a stanovení přesné trojrozměrné struktury proteinů klíčové pro identifikaci nízkomolekulárních ligandů, například látek, které mohou sloužit jako potencionální léčiva. Mezinárodní organizace HUPO (viz. dále) formulovala na svém workshopu konaném 7. října 2001 v Leesburgu ve státě Virginia cíle proteomiky poněkud přesněji jako identifikaci všech proteinů kodovaných lidským genomem (popřípadě genomy dalších, zejména tzv. modelových organismů) s následným stanovením a) jejich exprese v různých buňkách daného organismu, b) jejich subcelulární lokalizace v různých organelách, c) jejich posttranslačních modifikací, d) jejich vzájemných interakcí a e) vztahu mezi strukturou a funkcí (poslední oblastí se zabývá oblast strukturní genomiky).

Představu o složitosti výše zmíněných úkolů proteomiky nám nejlépe poskytne srovnání úkolů proteomiky s lidskou genomikou, resp. s projektem úplné sekvenace lidského genomu (Lander a spol., 2001). Ostatně název výše uváděné konference hovoří za vše „Human Proteome Project: Genes Were Easy”. Z hlediska počtu zkoumaných objektů se odhaduje počet lidských genů na 40 – 50 tisíc, zatímco (zatím velmi hrubý) odhad počtu všech proteinových produktů u člověka dosahuje zhruba 2 milionů. Kapacita informačních databází, která dosahovala u lidského genomu svého limitu, je tak u proteomických dat mnohonásobně překročena, a vede k diskusi o způsobech optimálního uspořádání a integrace řady dílčích databází do centrální databáze typu GenBank (podrobnější diskuse k databázím viz. www.hupo.org/link/databases.htm). Informace uložená v genech je definována v podstatě lineární sekvencí čtyř znaků (A, C, T, G) a je tedy jednorozměrná. Informace uložená v proteinech je mnoharozměrná, závislá na faktorech jako alternativní splicing, posttranslační modifikace, a konečně správné sbalení proteinu vedoucí k jednoznačné trojrozměrné struktuře definující biologii každého proteinu. Konečně je informace uložená v genech poměrně stabilní, zatímco proteom je časově proměnný, a často se nám mění před očima s podivuhodnou dynamikou (proteinové stroje, signalizační kaskády apod.) S tím vším souvisí skutečnost, že metodika pro výzkum proteomu je nesrovnatelně komplikovanější než postupy použité při sekvenování genomů. Zatímco lidský genom byl nakonec sekvenován během jednoho roku v několika sekvenačních továrních halách veřejných konsorcií a firmy Celera Genomics na robotických zařízeních a DNA sekvenátorech 3700 firmy Applied Biosystems, je pro řešení komplexního zadání lidské proteomiky nezbytná kombinace širokého spektra metodických přístupů od klasické chemie a biochemie proteinů až po nejnovější techniky robotického zpracování vzorků a mikroidentifikace proteinů hmotnostní spektrometrií.

 

Jaké jiné –omy ješte existují?

Aby byla situace pokud možno ještě komplikovanější, ukázalo se, že pro adekvátní popis komplexity biologických procesů samotný proteom nestačí. A tak se na nedávném sympoziu „Proteomic Forum 2001” v Mnichově intenzivně diskutovalo nejen o cestě od genomu k proteomu, ale též o DNA methylacích (methylom), proteinových glykosylacích (glykom) a fosforylacích (fosfoproteom) při buněčné signalizaci (signalom), popřípadě o využití poznatků proteomiky při výzkumu metabolických drah (metabolome) nebo farmakoterapiích (pharmacom). Je zřejmé, že zatímco další –omy příbývají každodenně a jsou limitovány snad jen fantazií svých „objevitelů” (slovníček rychle proliferujích –omů a –omik lze nalézt mj. na -Omes and -omics glossary), dostupné metodiky použitelné pro jejich faktický výzkum jsou často ještě složitější než je tomu u přístupů současné proteomiky. Přitom však zůstávají různé slabé vzájemné interakce proteinů založené například na protein – sacharidových nebo protein – lipidových interakcích v biologických systemech nesmírně důležité.

 

Projekty řešené současnou proteomikou

Přes veškerou komplexitu proteomiky nastíněnou v předcházejících odstavcích jsou projekty probíhající ve veřejném sektoru i u soukromých firem orientované převážně na řešení praktických problémů biomedicinského výzkumu. Velké americké státní instituce, jako je National Cancer Institute (NCI) nebo U.S.Food and Drug Administration (FDA) horují pro rychlou výchovu odborníků v proteomice a standardizaci příslušných metodik tak, aby se příslušná vyšetření co nejrychleji dostala k lůžku pacienta. Dva příklady takových projektů jsou uvedeny na obr. 1. Stejně jako se dostávájí do rutinního použití DNA diagnostické metody, počítá se s použitím speciálních technik laserového odběru asi jednoho tisíce buněk normální a nádorové tkáně, jejichž proteiny budou separovány na dvojrozměrných gelech, a abnormální proteiny identifikovány, produkovány rekombinantně, a řešena jejich trojrozměrná struktura jako podklad pro racionální farmakologickou intervenci (obr.1, horní panel). Podobně jako jsou dnes v krevním séru stanovovány různé biochemické a enzymatické parametry, budou vzorky séra podrobovány rutinní analýze po podání bežných léčiv, aby bylo možné hodnotit, které proteiny byly po podání léčiva indukovány, popřípadě které by se mohly účastnit vzniku vedlejších účinků (obr.1, dolní panel).

Jak proteomika pomáhá při vývoji léčiv

Obr. 1. Příklady použití metod proteomiky pro přímé monitorování a diagnostiku nádorových onemocnění, popřípadě pro sledování vedlejších účinků některých běžných léčiv.

Pro některé soukromé firmy se současné nadšení proteomikou stalo jakousi obdobou zlaté horečky poloviny 19. století (Service, 2001, viz. též část 4 věnovaná proteinovému patentování). Většina velkých farmaceutických firem investuje do nákupu přístrojů a počítačové techniky, a spolupracuje s akademickými pracovišti na různých proteomických projektech. Vzniká též mnoho nových firem, které přitahují pozornost volného kapitálu.

Odhady hovoří o tom, že zatímco v roce 1999 vložili investoři do těchto firem asi 700 milionů dolarů, v roce 2005 se bude jednat již o neuvěřitelných 5,6 miliard dolarů. Například firma GeneProt se sídlem u Ženevy a ve státě New Jersey investovala velmi masivně do nákupu přístrojů (zejména hmotových spektrometrů) a nejnovější počítačové techniky ve snaze získat náskok při srovnávací analýze proteomů zdravých a nemocných buněk, a identifikovat klíčové proteiny vhodné pro farmakologickou intervenci. Podobné cíle si klade firma Celera sídlící v Rockville ve státě Maryland. Biotechnologická společnost nejvíce proslavená právě sekvenováním lidského genomu, ale i genomů řady dalších modelových organismů, plánuje obdobně proteomické projekty zaměřené na srovnání proteinů normálních a nemocných tkání s cílem identifikovat proteiny charakteristické u určitých chorob, a na tyto proteiny zaměřit terapie založené na monoklonálních protilátkách, buněčných imunoterapiích, a klasických léčivech. Firma Cellzome sídlící v německém Heidelbergu byla založena vědci z Evropské laboratoře molekulární biologie (EMBL). Jejím cílem je zejména mapování proteinových komplexů a sestavení map proteinových interakcí v buňce. Firma CuraGen Corporation z New Haven ve státě Connecticut také zkoumá protein – proteinové interakce, přičemž je držitelem klíčového patentu na technologii „yeast two-hybrid method” (obr. 2). Tato technologie používá aktivátorů transkripce v kvasinkových buňkách, přičemž je jeden interagující protein označovaný jako návnada (bait) spojen zpravidla s jednou částí aktivátorového protein, a druhý interagující protein označovaný jako úlovek (prey) s druhou částí aktivátorového proteinu. Jestliže spolu oba proteiny opravdu interagují, způsobí přiblížení obou polovin aktivátorového proteinu s následnou aktivací transkripce, která je pozorována například jako změna barvy v kvasničné buňce. Firma MDS Proteomics sídlící v kanadském Torontu se zaměřuje na identifikaci nádorových proteinů vhodných pro zásah protilátek i běžných nízkomolekulárních léčiv. Ve svém hledání se zaměřuje zejména na receptory a proteiny intracelulárních signalizačních kaskád. Název firmy Myriad je odvozen od přečetných protein – proteinových interakcí a analýzy buněčných proteinových komplexů, které jsou důležité jako molekulární stroje (Alberts, 1998). Pro analýzu buněčných komplexů používá firma „yeast two-hybrid system”, a hmotovou spektrometrii. Dvě nové firmy (SGX a syrrx, obě v SanDiegu v Kalifornii) jsou zaměřené převážně na strukturní genomiku. Zaměřují se zejména na robotizaci a automatizaci metod proteinové krystalografie. Tato oblast zahrnuje optimalizaci postupů pro rekombinantní produkci proteinů v různých expresních systémech, a dále na velkoobjemovou produkci proteinových krystalů a jejich analýzu metodami difrakce rentgenových paprsků na proteinových krystalech (obr.3).

princip techniky yeast "two-hybrid assay"

Obr.2 Technika „yeast two-hybrid assay” slouží k výzkumu protein – proteinových interakcí v kvasinkové buňce.

difrakční obrazec a 3D model proteinu

Obr.3 Analýza struktury proteinu X-paprskovou krystalografií je založena na rekombinantní přípravě velmi čistého proteinu, který může tvořit proteinové krystaly. Po ozáření rentgenovským zářením vzniká difrakční obrazec (levá část obrázku), z něhož se dají získat koordináty jednotlivých atomů, a sestrojit trojrozměrný model proteinu (pravá část obrázku).

 

Lze proteiny patentovat stejně jako geny?

Patentování v oblasti genů vyvolalo nedávno značnou pozornost vědecké komunity, která vyvrcholila zejména v souvisloti s širokou dostupností informací získaných při sekvenování lidského genomu. Mezitím jsou ovšem některé soukromé společnosti, jako je například Human Genome Sciences v Rockvillu ve státě Maryland nebo Incyte Genomics sídlící v Palo Alto v Kalifornii nositelem více něž 25000 patentů souvisejících s maximálním vytežením (angl. mining) informací nacházejících se v lidském genomu. Za skandální se považuje zejména fakt, že mnohdy jsou patentové nároky těchto soukromých firem založené na informacích získaných veřejným konsorciem HUGO financovaným z peněz daňových poplatníků. Řada firem, jako je například Oxford GlycoSciences ve Velké Británii nyní argumentuje, že to není gen, který v sobě skrývá informaci nezbytnou pro praktické využití, ale právě jednotlivé proteinové produkty. Možnosti patentových právníků jsou zde samozřejmě prakticky neomezené, vzhledem k ohromnému množství proteinových produktů. Předpokládá se nicméně, že v případě, že bude mít určitá soukromá společnost zájem na patentovém využití určitého genu, a dostane se do sporu s jinou firmou nesoucí patentové nároky na příslušný genový produkt, pokusí se v prvém kole spíše o dohodu a zařízení sublicence, aby se vyhnula obtížným soudním sporům spojeným se vznášením vzájemně protichůdných nároků (angl. litigations). Takové spory již mají s vědeckým výzkumem pouze málo společného, a slouží pouze potřebám velmi drahých advokátů.

 

Kdo koordinuje výzkum v proteomice?

Zatímco výzkumné projekty v proteomice probíhají u soukromých firem za přísně utajovaných okolností, ujala se koordinace veřejně financovaných projektů organizace HUPO. Podobně jako v historii organizace HUGO pozorujeme, že vývoj projektu lidského proteomu je v současné době v počátcích. Cílem této zhruba dvouleté etapy je koordinace jednotlivých výzkumných center do národních a mezinárodních sítí, a vytyčení standardů a cílů projektu lidského proteomu. Technologicky je projekt lidského proteomu odlišný od projektu lidského genomu – používá kombinace klasických postupů chemie a biochemie proteinů s technologicky pokročilými procesy, jako je automatizace, robotizace a vývoj nových, výkonnějších přístrojů. To vede k možnosti zapojení vědců i z těch zemí, které mají v chemii a biochemii proteinů velkou tradici, a přitom se neúčastnili sekvenace lidského genomu. V materiálu organizace HUPO je specificky zmiňován příklad Ruska, kde v Moskvě vyrostlo velké centrum proteomiky pod vedením profesora Archakova. Velmi aktivní v proteomických iniciativách jsou asijské země jako Korea nebo Singapore (o vědcích z České republiky nepadne, podobně jako v případě genomového projektu ani slovo, a to i přes velkou tradici proteinového výzkumu na mnoha domácích pracovištích).

Na nedávném workshopu formulovala společnost HUPO cíle projektu lidského proteomu pro nejbližší období. Bylo konstatováno, že projekt bude procházet dvouletou iniciační fází a bude kombinovat výzkum v oblasti expresní proteomiky, funkční proteomiky a bioinformatiky. Stanovení realistických cílů, a vývoj nových technologií bude v nějbližším období kritické. Bude poskytována všemožná podpora již existujícím výzkumným konsorciím v akademickém sektoru, jako je například Alliance for Cell Signaling. Bude podporována tendence k integraci jednotlivých skupin zabývajících se proteomikou do velkých center, která by se měla stát základem celosvětové sítě proteomických pracovišt. Byla zdůrazněna nezbytnost výchovy odborníků v proteomice, kterých je oproti genetickému výzkumu nedostatek, a též nezbytnost široké dostupnosti proteinových standardů, aby mohly být srovnávány výsledky získané v různých skupinách.

 

Nástroje současné proteomiky – od laboratorních technik k proteomickým továrnám

O nezbytnosti vývoje nových výzkumných nástrojů v proteomice již bylo pojednáváno na několika místech této kapitoly. Je zřejmé, že uplatnění některých klasických technik proteinové analýzy bude v moderní proteomice stále více omezené. Takové techniky, které nejsou dostatečně citlivé, a neumožňují snadnou automatizaci a robotizaci jsou postupně nahrazovány novými přístupy. Typickým příkladem techniky spíše ustupující je Edmanovo odbourávání proteinů v proteinovém sekvenátoru, který se vyskytuje v moderních proteomických projektech spíše vzácně. Pravý opak představuje hmotová spektrometrie proteinů, v níž probíhá naopak rozvoj instrumentace exponenciálním způsobem. Hmotové spektrometry se stávají přesnějšími (FT-MS) a zejména citlivějšími, takže se objevuje reálná možnost získání sekvenční informace pro množství proteinů a peptidů odpovídající několika tisícům molekul (právě taková citlivost je přitom potřebná pro analýzu nízkokopiových proteinů z buněčných vzorků získaných laserovou technikou odběru (Obr.1). Vývoj účinných metod štěpení proteinu přímo v gelech ve spojení s technikou nanoLC-MS/MS umožňuje stanovit několik interních sekvencí z proteinové skvrny na hranici barvitelnosti proteinovými barvivy typu Coomassie (cca 50 ng proteinu).

Následuje krátká diskuse nových technik a technologií vyvinutých v poslední době speciálně s ohledem na proteomický výzkum. V současné době probíhají v proteomické komunitě velmi živé diskuse k otázce použití polyakrylamidových gelů, a zastánci proteomiky bez gelu mají stejně dobré argumenty jako jejich oponenti trvající na gelových separacích proteinů. Ať tak či onak, technika dvojrozměrné polyakrylamidové elektroforesy (Obr.4) stále zůstává vzhledem ke své unikátní separační schopnosti základem mnoha proteomických projektů. Použití imobilizovaných pH gradientů v prvém rozměru do velké míry vyřešilo problém reprodukovatelnosti prvého rozměru (isoelektrická fokusace), i když přetrvávají tradiční problémy s analýzou proteinů příliš malých nebo příliš velkých, příliš kyselých nebo příliš bazických apod. U některých látek, jako jsou například malé proteiny a peptidy se proto pro jejich separaci dává přednost chromatografickým postupům, často též prováděným v nekolikarozměrném uspořádání (například kombinace iontomeničů a obrácené fáze). Objevují se stále nové metody diferenční identifikace proteinů. Firmou Amersham Pharmacia Biotech byla nedávno zavedena vtipná technika pro srovnání proteinových diferencí ve dvou vzorcích založená na použití fluorescenčních sond.

příklad 2-D elektroforézy

Obr.4 Technika dvojrozměrné gelové elektroforesy separuje směs proteinů podle jejich isoelektrických bodů (zleva doprava) a velikosti (zeshora dolů). Po separaci mohou být jednotlivé proteinové skvrny štepeny přímo v gelu a identifikovány hmotovou spektrometrií. Dvojrozměrná gelová elektroforesa může separovat až několik tisíc proteinů.

Podobnou funkci mají isotopově značené afinitní značky používané v hmotové spektrometrii. Moderní hmotový spektrometr vybavený například iontovou pastí je totiž velmi mohutný separační a analytický instrument schopný během hodiny akumulovat tisíce fragmentačních spekter při analýze komplexních peptidových směsí jaké vznikají například při analýze protienových komplexů. Hledání určitých změn v proteinových profilech pak připomíná hledání jehly v kupce sena. Selektivní značení určitých aminokyselin (napřiklad cysteinu) pomocí isotopově značených sond nejen značně zjednoduší výsledný peptidový obraz, ale umožňuje rychle a efektivně nalézt změny proteinových profilů (Obr.5).

graf

Obr.5 Hmotové spektrum ze srovnávací proteomické analýzy dvou blízce příbuzných vzorků s použitím isotopově značené hmotnostní sondy. Normální zdravá buňka je značená sondou obsahující lehké isotopy (levý pík), nádorově transformovaná buňka sondou s těžkými isotopy (pravý pík). Změna poměru obou píků je mírou změny poměru exprese obou proteinů.

Vývoj tzv. proteinových čipů je v poslední době dosti pomalý, objevily se nicméně prvé publikované práce používající této proteomické technologie. Proteinové čipy jsou miniaturizovaná plošná zařízení, na kterých jsou imobilizované specifické proteinové sondy nejčastěji povahy protilátek. Interakce s cílovým proteinem je detekována pomocí fluorescence, jinou optickou metodou (například změnou refraktivního indexu na zlatém čipu u zařízení typu BIA CORE), popřípadě hmotově spektrometrickou technikou.

Mikrofluidika je další rychle se rozvíjející technikou řešící potřeby přípravy proteinových vzorků. Reakční zkumavky jsou většinou nahrazeny malými kyvatemi a trubičkami, které umožňují provádět komplexní reakční sekvence včetně extrakčních a purifikačních kroků. Celý systém proteinových reaktorů je umístěn zpravidla na malém centrifugačním kotouči (Obr.6), jehož rychlé roztočení poskytuje hnací sílu pro zahájení jednotlivých reakcí. Veškeré reakce probíhající v těchto centrifugačních reaktorech jsou miniaturizované, což dramaticky zvyšuje rychlost a citlivost proteomických analýz.

centrifugační kotouč

Obr.6 Konstrukce centrifugačního mikroreaktoru pro proteomické studie. Jsou patrné jednotlivé reakční komůrky velmi malých rozměrů, k zahájení reakcí se použije rychlé roztočení mikroreaktoru v centrifugačním zařizení.

Všechny výše uvedené techniky jsou poté integrovány do proteomických robotických linií, které jsou schopny automaticky provádět kompexní analýzy bez zásahu člověka. Technologie robotického zpracování vzorků byla převzata z automobilového průmyslu. Například robotická pracovní stanice znázorněná na obr. 7 je konfigurovaná pro provádění opakovaných operací jako je pipetování nebo dokonce výměnu kultivačních buněčných medií. Zařizení je vybaveno termostaty, inkubátory a extrakčními bloky. Automatizovaná zařizení tohoto druhu jsou nyní dodávána i pro přípravu vzorků pro hmotovou spektrometrii. Přístrojové celky zobrazené na obr.7 jsou poté integrovány do velkých továrních hal určených pro řešení komplexních projektů proteomiky. Například tovární hala již zmiňované společnosti GeneProt obsahuje 51 hmotových spektrometrů nejnovějšího typu v celkové ceně 7,6 milionů dolarů. Množství dat produkovaných takovým soustředěním přístrojové techniky je také ohromné, firma právě uzavřela smlouvu na jeden z nejvýkonnějších počítačů v civilním sektoru.

Robotická automatická stanice pro přípravu vzorku v proteomice

Obr.7 Robotická automatická stanice pro přípravu vzorku v proteomice (popis viz. text).

 

Nejdůležitejší výsledky proteomiky v posledních letech

Jaké jsou nejdůležitější výsledky současné proteomiky, pokud odhlédneme od technických novinek a zvýšení ceny akcií biotechnologických firem? Zdá se, že zatímco v některých směrech projektu lidského proteomu jde nyní teprve o stanovení základních úkolů, proteomické techniky již přinesly řadu zajímavých poznatků zejména při analýze proteinových komplexů a proteinových interakcí. Analýza proteinových komplexů je jednou z domén současné proteomiky. Klasickým a zkušebním příkladem je analýza proteinového složení některých proteinových strojů, jako je ribosom, proteasom, spliceosom apod. (Alberts, 1998). Analýza všech proteinových komponent ribosomů byla důležitým testem při vývoji experimentálních technik proteomiky. Ribosomální proteiny jsou již mnoho let analyzovány na dvojrozměrných gelech, nedávno byla pro analýzu ribosomů velmi úspěšně použita proteomika bez gelu po trypsinovém štěpení celého ribosomu. Protein – proteinové interakce jsou aktivně zkoumány zejména u kvasinek. Při použití yeast two-hybrid systemu bylo analyzováno asi 6000 kvasničných transformantů, a identifikovány interakce pro 192 proteinů Saccharomyces cerevisiae (Uetz a spol., 2000). Podobné výsledky byly získány u kvasinek s použitím technologie proteinových čipů. S použitím zdokonalené techniky tandemové afinitní purifikace byla analyzována tvorba proteinových komplexů u 1793 kvasinkových proteinů. Hmotovou spektrometrií bylo identifikováno celkem 232 proteinových komplexů, přičemž některé z nich byly složeny i z více než 40 proteinů (Gavin a spol., 2002). Tato analýza proteinové interakční sítě v kvasinkách má velký potenciální význam i pro lidský proteom, protože velká řada těchto proteinových komplexů je evolučně velmi konzervovaná, a může být relevantní i pro biologii lidské buňky.

 

Závěr a perspektivy

Současná proteomika je velmi aktivní oblastí biomedicinského výzkumu. Většina velkých farmaceutických firem otevřela proteomická centra, objevilo se velké množství nových biotechnologických společností, které mají proteomiku jako svůj hlavní program, ať již jde o vývoj nových metodik, nových databází a softwarového vybavení, nebo o firmy angažované v některým z proteomických programů. Výzkum v proteomice podporovaný veřejnými organizacemi je koordinován mezinárodní organizací HUPO, která předpokládá během dvou let formulování otevřeného a deregulovaného programu, do něhož se mohou zapojit i organizace ze zemí, které neparticipovaly na sekvenování lidského genomu. Již koncem letošního roku bude pokrok dosažený v projektu lidského proteomu diskutován na prvém. světovém kongresu ve Versailles u Paříže. Organizace HUPO očekává účast více než 1600 odborníků z veřejného i soukromého sektoru. Jsme tedy nyní uprostřed přípravné fáze tohoto projektu, takže by koncem roku již mělo být zřejmé, jaké priority budou v tomto projektu vytýčeny. V této souvislosti bude nanejvýš aktuální zhodnotit i možnosti účasti českých výzkumných skupin v tomto novém důležitém projektu.

 

Doporučená literatura

Webové stránky

Sponsoři